PCR test
Maximilian Reindl studirao je kemiju i biokemiju na LMU u Münchenu, a član je uredničkog tima -a od prosinca 2020. godine. Upoznat će se s vama o temama medicinske, znanstvene i zdravstvene politike kako bi bile razumljive i razumljive.
Još postova od Maximilian Reindl Sav sadržaja provjeravaju medicinski novinari.PCR testovi postali su neizostavan dio suvremene medicine i molekularne dijagnostike. Budući da su toliko precizni, smatraju se "zlatnim standardom". Mogu se koristiti u širokom rasponu primjena, od otkrivanja patogena do probira nasljednih bolesti - tj. Gdje god je potrebno pouzdano otkriti i najmanje tragove nasljednog materijala. Ovdje saznajte zašto je PCR test toliko precizan, gdje se koristi i kako detaljno radi.
Što je PCR test?
PCR test laboratorijska je metoda iz molekularne biologije i medicine. Test se koristi za izravno otkrivanje - i karakterizaciju - genetskog materijala. Stručnjaci smatraju da je PCR metoda jednostavna za provođenje, univerzalno primjenjiva i robusna.
U laboratoriju se PCR test sastoji od dva koraka. U prvom koraku, postojeći se genetski materijal reproducira uz pomoć lančane reakcije polimeraze, ili skraćeno PCR -a. Na taj način se mogu ispitati i najmanji tragovi DNK. To je i razlog zašto su PCR testovi toliko osjetljivi.
U drugom koraku, genetski materijal se odvaja, "sortira" i tako karakterizira prema svojim svojstvima. Tako se određuje fina struktura DNK.
Postoji mnogo mogućih upotreba: Liječnici koriste PCR test kako bi ispitali, na primjer, razmaze na koronaviruse, dobrovoljne darove krvi za HIV ili pregledali novorođenčad na moguće nasljedne bolesti. Bakterijske infekcije - na primjer patogenom tuberkuloze - ili parazitske infekcije (malarija) također se mogu razjasniti pomoću PCR -a.
Oni također pomažu u sudskoj medicini da osude počinitelje na temelju njihovog genetskog otiska prsta ili se koriste kao testovi očinstva.
Sve ove aplikacije sažete su pod pojmom molekularna dijagnostika. PCR stoga pronalazi praktičnu primjenu u istraživanju, dijagnostici i forenzici daleko izvan otkrivanja patogena Sars-CoV-2.
(Corona) PCR test u odnosu na brzi PCR test
Obično se procjena PCR testa odvija u specijaliziranom laboratoriju. To znači da se uzorak materijala tamo šalje i pregledava. Obično se rezultat dobije nekoliko dana kasnije.
Razni startupi (GNA Biosolutions, Spindiag) nedavno su predstavili nove vrste mobilnih testnih uređaja. Za to su dobili i posebna odobrenja Federalnog zavoda za lijekove i medicinske proizvode (BfArM). Uz pomoć ovih mobilnih uređaja za testiranje PCR -a, PCR test bio bi moguć i bez specijaliziranog laboratorija.
Ovaj pristup ima veliki potencijal jer bi pouzdan rezultat ispitivanja mogao biti dostupan u roku od nekoliko sati izravno na mjestu gdje je uzorak uzet (centar za ispitivanje).
Još se ne može procijeniti u kojoj će mjeri takvi brzi PCR testni sustavi prevladati u praksi. Također još nije poznato koliko će brzo ispitni centri biti isporučeni s ovim uređajima.
Stoga će se u dogledno vrijeme nastaviti provoditi "redoviti" laboratorijski PCR testovi koji uzrokuju određeno kašnjenje između uzorkovanja i rezultata ispitivanja.
Koliko je pouzdan PCR test?
PCR je dokazana metoda otkrivanja u molekularnoj dijagnostici i medicini. Smatra se takozvanim zlatnim standardom s vrlo niskom stopom pogrešaka. Testove posebno odlikuje vrlo visoka osjetljivost i specifičnost.
Osjetljivost znači pouzdanost s kojom se testom pronalazi genetski materijal koji treba otkriti.
Specifičnost znači sigurnost s kojom se testom utvrđuje da dotični genetski materijal nije prisutan u uzorku.
Kada rade PCR testovi u slučaju infekcije Sars CoV-2?
U pravilu, PCR test otkriva infekciju koronom dva do tri dana prije i do 20 dana nakon pojave simptoma. Čak i kod zaraženih ljudi koji su potpuno bez simptoma, test radi u kritičnom vremenskom razdoblju kada mogu zaraziti druge.
U pojedinačnim slučajevima dokaz je to čak moguć 60 dana nakon pojave simptoma bolesti.
Prvi dan nakon infekcije koronom, PCR test također može biti negativan, iako je prisutna infekcija. U tom slučaju u vrijeme ispitivanja brisa nije bilo dovoljno virusa u grlu. Međutim, ako postoji osnovana sumnja na infekciju, liječnici obično sljedećih dana provode još jedan PCR test.
mogući izvori grešaka
Stopa pogrešaka u procesu kopiranja DNA zanemariva je u praksi. Iako DNA polimeraze nikada ne rade ispravno, teško da igraju ulogu u procesu PCR testa.
U praksi, mogući izvori grešaka leže u procesu uzorkovanja: Stoga je važno da obučeno medicinsko osoblje izvrši briseve. Uzorci sline i grgljanja mogli bi smanjiti točnost jer se ovdje pojavljuju učinci razrjeđenja.
Kako radi PCR test?
PCR test provodi, na primjer, obiteljski liječnik ili u posebnim ispitnim centrima. Prvo, liječnici ili obučeni zdravstveni djelatnici uzimaju uzorak. Obično se za test uzima bris iz gornjih dišnih putova. To obično ima oblik brisa iz usta ili nosa i grla.
Moguće je i grgljanje otopinom za ispiranje. Uzorak krvi nije atipičan za otkrivanje korone - ali je raširen, na primjer, pri pregledu novorođenčadi.
Bez obzira na vrstu uzetog uzorka, genetski materijal nalazi se na vati, u otopini za ispiranje ili u kapi krvi. Ovaj uzorak materijala šalje se u laboratorij, gdje se izolira i pročišćava.
PCR test tada se dijeli u dva koraka:
- PCR: U ovom koraku množi se količina izvornog genetskog materijala.
- Elektroforeza: U drugom koraku se segmenti genoma "sortiraju" prema veličini. Na taj se način uzorak može okarakterizirati - utvrđuje se fina struktura genetskog materijala.
Korak 1: PCR - "Lančana reakcija polimeraze"
"PCR" je prvi od dva radna koraka: Ovdje se količina postojeće početne DNK množi. Jer samo ako je genetski materijal dostupan u dovoljnoj količini, može se ispitati. Uglavnom je to ljudska DNK; testovi na koronavirus su u skladu s tim RNA virusa.
Kratica PCR označava engleski izraz "Polymerase Chain Reaction".
Što je potrebno za PCR?
Početna DNA nalazi se u reakcijskoj posudi s posebnim tvarima. Postojeći genetski materijal služi kao predložak, koji se kopira u prisutnosti određenih enzima (Taq polimeraza) i određenih osnovnih građevnih blokova DNA.
Proces kopiranja odvija se u nekoliko ponavljajućih ciklusa (ciklusa).
Konkretno, sljedeće tvari se kombiniraju:
- Početna DNK: materijal uzorka koji će se replicirati.
- Osnovni građevni blokovi DNK: To su nukleobaze adenin, timin, citozin i gvanin.
- DNA polimeraza: Enzim koji povezuje pojedine građevne blokove DNK kako bi formirao dobro definiranu nit DNK. Novo dobiveni pramen zrcalna je (komplementarna) slika izvornog početnog materijala.
- Puferska otopina: Lančana reakcija polimeraze odvija se u fiziološkoj otopini pufera. Time se osiguravaju uvjeti slični onima koji se nalaze u ljudskim stanicama. Ova otopina održava pH stabilan, a također sadrži magnezijeve ione. Ti kontrolirani uvjeti neophodni su za osiguranje funkcionalnosti DNA polimeraze.
- Temeljni premazi: Sastoje se od 16 do 24 parova baza i služe kao startni položaj i startni signal. Primeri pokazuju DNA polimerazu u kojoj trenutku (početne DNA) započinje proces kopiranja.
Kako se vrši PCR test?
Budući da su sve tvari potrebne za PCR sada u reakcijskoj posudi, može započeti stvarni proces kopiranja genetskog materijala. To se samo pokreće, kontrolira i opet zaustavlja zbog temperature.
Reakcijska posuda se posljedično zagrijava ili ciljano hladi na različite temperature. To se radi posebnim uređajem - takozvanim termalnim ciklerom. Ukupna reakcija traje oko jedan do dva sata.
Pojedinačni koraci PCR ciklusa su:
- Denaturacija dvostrukih niti DNK: Uzorak se zagrijava na oko 90 stupnjeva Celzijusa. Kao rezultat toga, izvorni dvostruki lanac DNA razbija se u dva odvojena (komplementarna) pojedinačna lanca.
- Pričvršćivanje temeljnog premaza: Temperatura se snižava na nešto ispod 60 stupnjeva Celzijusa. Kao rezultat toga, početnici (početni početnici, obrnuti početnici) pričvršćuju se na definirane položaje na odgovarajućim pojedinačnim lancima DNA.
- Produžetak: Temperatura se povećava na nešto iznad 70 stupnjeva Celzijusa. DNA polimeraza sada počinje svoj rad pri ovom temperaturnom optimumu. Pričvršćuje se na početne položaje i proširuje izvorni pojedinačni lanac DNA korak po korak sve dok ne bude dostupna točna (komplementarna) kopija (sinteza DNA).
Nakon završenog ciklusa, temperatura se ponovno povećava na oko 90 stupnjeva Celzijusa - ciklus počinje iznova.
Pomoću PCR metode, DNK sekvence mogu se replicirati do oko tri para kilobaza (kbp). To odgovara oko 3.000 osnovnih građevnih blokova DNK povezanih u "lanac". Za usporedbu: ljudski genom pohranjuje nacrte i informacije za rad stanice u oko tri milijarde parova baza - genom koronavirusa, s druge strane, sastoji se od 30.000 parova baza. PCR test može se koristiti samo za reprodukciju i ispitivanje kratkih dijelova ukupne DNA.
Temeljni premazi su ključni
Odabir prajmera ključan je za PCR proces. Na primjer, u dijagnostici Sars-CoV-2 koristi se nekoliko primera (multipleks PCR).
Korona PCR testovi traže tri različita gena virusa: Ukupna specifičnost povećava se na gotovo 99,99%. To znači da s ovom visokom stopom pogodaka postoji samo jedan lažno pozitivan test na 10.000 pregleda (ako je uzorak pravilno uzet).
Koliko sada postoji kopirani genetski materijal?
Pretpostavimo da nakon prvog ciklusa postoje dvije identične dvostruke niti DNK.
Nakon svakog ciklusa, količina (kopiranog) genetskog materijala se udvostručuje. Tako količina DNA raste eksponencijalno.
Drugim riječima: nakon drugog ciklusa postoje četiri identične dvostruke niti - nakon trećeg ciklusa osam dvostrukih niti - nakon četvrtog ciklusa 16 dvostrukih niti, a nakon petog ciklusa već 32 dvostruke niti.
Medicinski stručnjaci obično ponavljaju ovaj postupak dvadeset do trideset puta.
Metaforički rečeno, to znači: Čak i ako je u uzorku na početku pronađena samo jedna dvostruka lančana DNK, nakon dvadeset ciklusa u reakcijskoj posudi će već biti milijun identičnih kopija.
Što znači vrijednost Ct?
Broj dovršenih ciklusa PCR-a dat je u obliku takozvane vrijednosti Ct. "Ct" je izvedeno iz engleskog izraza "prag ciklusa". Ova vrijednost Ct omogućuje davanje izjava o količini traženog genetskog materijala.
Pri niskoj vrijednosti Ct od 20, postoji mnogo početnog genetskog materijala. Međutim, ako je vrijednost Ct visoka - oko 30 ciklusa - prema tome ima malo DNK. Stoga se PCR ciklus mora češće provoditi.
Korak 2: Elektroforeza "Sortiranje po veličini"
Konačno, ako postoji dovoljno „obogaćenog“ genetskog materijala, može se dogoditi ono što je poznato kao elektroforeza. Znanstvenici koriste određeno svojstvo DNK: njezin električni naboj.
Pojedinačni građevni blokovi DNA međusobno su povezani (negativno) nabijenom okosnicom šećer-fosfata. Što je određeni niz DNK duži, to je njegov električni naboj veći.
Ako se genetski materijal stavi u određeni medij nosač (agarozu) i primijeni električni napon, segmenti DNA počinju se pomicati zbog svog naboja. Budući da duži dio DNK putuje brže od kraćeg fragmenta, oni se odvajaju prema veličini.
Na taj se način može ispitati i okarakterizirati genetski materijal. U praksi se nepoznati uzorak s poznatom referencom obično primjenjuje na "početnu liniju" i uspoređuje jedan s drugim nakon određenog vremenskog razdoblja.
Ako je "brzina migracije" ista za obje sekvence, to znači: Otkrivanje je vrlo vjerojatno pozitivno - gen koji tražite nalazi se u uzorku.
Poseban slučaj koronavirusa: priprema uzoraka i RT-PCR
Poseban je slučaj otkrivanje patogena koronavirusa. Sars-CoV-2 jedan je od takozvanih RNA virusa. To znači da je genom Sars-CoV-2 u obliku RNA (ribonukleinske kiseline).
RNA se razlikuje od DNA samo na nekoliko načina. Između ostalog, dostupan je kao jedan lanac i temelji se na šećernoj ribozi umjesto na 2 "deoksiribozi. Nukleobazinski timin također je zamijenjen uracilom kao četvrtom bazom.
Ova virusna RNA mora se "prepisati" u DNK prije redovnog PCR testa. Taj se proces naziva reverzna transkripcija (RT) - otuda i naziv RT -PCR. Tijekom tog procesa dobiva se jedan lanac cDNA ("komplementarna DNA"). U sljedećem koraku, jedan cDNA lanac nadopunjen je drugim, ogledalom obrnutim DNK lancem.
Na kraju pripreme uzorka nalazi se dvostruki lanac DNA koji odgovara izvornom planu virusne RNA: Samo se ovaj dvostruki lanac sada može koristiti kao predložak u PCR testu.
Koliko je vremena potrebno za postizanje rezultata?
Nakon što pošaljete uzorak u laboratorij, obično ćete dobiti rezultat nakon jednog ili dva radna dana.U ispitnim centrima, koji često pregledavaju uzorke na licu mjesta, to može potrajati samo nekoliko sati. Vremensko razdoblje uvelike ovisi o odgovarajućem ispitnom centru i njegovoj logistici.
Unatoč složenim radnim procesima, moderni laboratoriji mogu provesti PCR testove s velikom propusnošću. Posebni automatizirani uređaji pomažu u implementaciji.
PCR test se još uvijek smatra relativno "sporim", ali još pouzdanijim načinom otkrivanja.
Što se događa ako je rezultat pozitivan?
Ako je uzorak ispravno uzet, pozitivan PCR test znači da je testirana osoba vrlo vjerojatno zaražena Sars-CoV-2.
Ako vam je potvrđeno da ste zaraženi koronavirusom uz pomoć PCR testa, zdravstveni odjel primit će poruku iz odgovarajućeg laboratorija o pozitivnom rezultatu testa. U tom će slučaju zdravstveni odjel odrediti izolaciju ili karantenu.
Jesam li automatski zarazan ako dobijem pozitivan PCR test?
Većinu vremena da. Ali ne uvijek. Rezultat PCR testa uvijek treba tumačiti u kontekstu. Pozitivan test prvenstveno znači da u sebi imate virusni materijal.
Ako ste tek nedavno patili od Covid -19 (nekoliko dana), PCR test bi i dalje mogao biti pozitivan - iako ste već opet zdravi. Ovo je poseban slučaj i loša strana vrlo osjetljivog testa jer može otkriti i fragmente virusa koji se ne mogu reproducirati.
Dodatni test na antitijela ponekad je koristan
U takvim slučajevima test na antitijela daje sigurnost koja osigurava valjanost PCR testa. O tome je najbolje razgovarati sa svojim liječnikom. Oni vam mogu pomoći da ispravno protumačite rezultat PCR testa.
Što učiniti ako je rezultat negativan
Negativan rezultat PCR testa znači da postoji velika vjerojatnost da niste uzeli Covid-19 kada je uzorak uzet, pa stoga trenutno nisu zarazni. Međutim, mogli biste biti u ranoj fazi infekcije.
Obično se korona infekcije mogu otkriti tek drugi ili treći dan nakon infekcije. Dakle, rezultat nije besplatna ulaznica. Stoga biste trebali i dalje poštivati pravila o udaljenosti i higijeni te nositi masku FFP2 - za sebe i za zaštitu drugih.
PCR test kod djece
Pedijatrijski PCR test ne razlikuje se od PCR testa za odrasle. I uzorkovanje i tumačenje rezultata primjenjuju se i na djecu i na odrasle.
Koji su rizici PCR testa?
PCR test ne predstavlja fizički rizik. Samo uzimanje uzorka brisom iz nazofarinksa neki ljudi doživljavaju kao dosadno ili neugodno.
Koliko košta PCR test?
Svi troškovi za PCR test bit će podmireni ako vaši liječnici ili zdravstveni odjel odobre takav test. Naknada troškova obično se razmatra ako već imate vlastite simptome ili ste imali izravan kontakt sa zaraženim osobama.
Čak i u slučaju pozitivnog brzog testiranja ili samotestiranja, imate pravo na besplatni PCR test.
Napomena: Ako ste se testirali kod kuće i dobili pozitivan rezultat, trebali biste se odmah telefonski dogovoriti sa svojim obiteljskim liječnikom. Vaš će liječnik telefonski razgovarati s vama o daljnjem postupku.
Alternativno, najbolje je nazvati 116 117 kako biste se prijavili za PCR test. Do potvrdnog testa idealno bi bilo da ostanete kod kuće kako biste zaštitili sebe i druge.
